กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง: หลักการของวิธีการ

การดูดซึมและการทำให้เกิดแสงซ้ำอีกด้วยแสงอินทรีย์และอนินทรีย์เป็นผลจากการเรืองแสงหรือการฟลูออเรสเซนต์ ความแตกต่างระหว่างปรากฏการณ์ประกอบด้วยระยะเวลาระหว่างช่วงการดูดซึมของแสงและการไหลของฟลักซ์ ภายใต้การเรืองแสงกระบวนการเหล่านี้เกิดขึ้นเกือบพร้อมกันและมีการเรืองแสงด้วยความล่าช้าบางอย่าง

ภูมิหลังทางประวัติศาสตร์

ในปี ค.ศ. 1852 นักวิทยาศาสตร์ชาวอังกฤษ Stokes ได้กล่าวถึงการเรืองแสงเป็นครั้งแรก เขาแนะนำศัพท์ใหม่อันเป็นผลมาจากการทดลองกับ fluorspar ซึ่งปล่อยแสงสีแดงภายใต้อิทธิพลของรังสีอัลตราไวโอเลต Stokes สังเกตเห็นปรากฏการณ์ที่น่าสนใจ เขาพบว่าความยาวคลื่นที่มีรังสีเรืองแสงอยู่เสมอมากกว่าการไหลของแสงกระตุ้น

เพื่อยืนยันสมมติฐานในศตวรรษที่ 19 มีการทดลองจำนวนมาก พวกเขาแสดงให้เห็นว่ามีหลายตัวอย่างที่เรืองแสงภายใต้การกระทำของรังสีอัลตราไวโอเลต ท่ามกลางวัสดุอื่น ๆ ได้แก่ คริสตัลเรซิ่นแร่ธาตุคลอโรฟิลล์วัตถุดิบยาสารอนินทรีย์วิตามินน้ำมัน การประยุกต์ใช้สีย้อมเพื่อการวิเคราะห์ทางชีววิทยาโดยตรงเริ่มขึ้นในปีพ. ศ. 2473

กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง: คำอธิบาย

วัสดุบางอย่างที่ใช้ในการศึกษาครึ่งปีแรกของศตวรรษที่ 20 มีความจำเพาะสูง стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. เนื่องจากตัวบ่งชี้ที่ไม่สามารถทำได้ด้วยวิธีการตรงกันข้ามวิธี การของกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงได้ กลายเป็นเครื่องมือสำคัญในการวิจัยชีวการแพทย์และชีววิทยาทั้ง ผลลัพธ์ที่ได้นั้นไม่มีนัยสำคัญสำหรับวิทยาศาสตร์วัสดุ

? ข้อดีของกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง คืออะไร? ด้วยความช่วยเหลือของวัสดุใหม่มันเป็นไปได้ที่จะแยกเซลล์ที่เฉพาะเจาะจงมากและชิ้นส่วน submicroscopic กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงสามารถตรวจจับโมเลกุลแต่ละตัวได้ ความหลากหลายของสีช่วยให้การระบุองค์ประกอบหลายอย่างในเวลาเดียวกัน แม้จะมีข้อ จำกัด ในเชิงพื้นที่ของอุปกรณ์โดย จำกัด การเลี้ยวเบนซึ่งจะขึ้นอยู่กับคุณสมบัติเฉพาะของตัวอย่างนอกจากนี้ยังสามารถตรวจจับโมเลกุลที่อยู่ต่ำกว่าระดับนี้ ตัวอย่างต่างๆหลังจากการฉายรังสีแสดงการหลั่งของแสง ปรากฏการณ์นี้ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในด้านธรณีวิทยาพฤกษศาสตร์อุตสาหกรรมเซมิคอนดักเตอร์

คุณสมบัติ

การศึกษาเนื้อเยื่อสัตว์หรือเชื้อจุลินทรีย์ที่ทำให้เกิดโรคมักจะมีความซับซ้อนโดยการเรืองแสงอัตโนมัติที่ไม่รุนแรงหรือไม่แข็งแรงมากเกินไป อย่างไรก็ตามความสำคัญในการศึกษาคือการนำเข้าวัสดุของส่วนประกอบที่ตื่นเต้นที่ความยาวคลื่นโดยเฉพาะและเปล่งแสงจากความเข้มที่ต้องการ Fluorochromes ทำหน้าที่เป็นสีย้อมที่สามารถยึดติดกับโครงสร้าง (มองไม่เห็นหรือมองเห็นได้) ในเวลาเดียวกันพวกเขาจะเลือกอย่างมากเกี่ยวกับเป้าหมายและผลผลิตควอนตัม

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง ได้กลายเป็นใช้กันอย่างแพร่หลายกับการถือกำเนิดของสีย้อมธรรมชาติและสังเคราะห์ พวกเขามีรูปแบบที่ชัดเจนของความเข้มของการปล่อยและการกระตุ้นและมุ่งเป้าไปที่เป้าหมายทางชีวภาพที่เฉพาะเจาะจง

การระบุโมเลกุลแต่ละตัว

บ่อยครั้งภายใต้สภาวะที่เหมาะสมคุณสามารถลงทะเบียนการเรืองแสงของแต่ละองค์ประกอบได้ ในการทำเช่นนี้สิ่งอื่น ๆ จำเป็นต้องตรวจจับสัญญาณรบกวนเครื่องตรวจจับต่ำและพื้นหลังแบบออปติคัล โมเลกุลของ fluorescein ก่อนที่จะถูกทำลายเนื่องจาก photobleaching สามารถเปล่งแสงได้ถึง 300,000 โฟตอน ที่ 20% ของการเก็บรวบรวมและประสิทธิภาพของกระบวนการที่พวกเขาสามารถลงทะเบียนในจำนวนประมาณ 60,000

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. การเรืองแสงด้วยกล้องจุลทรรศน์ ขึ้นอยู่กับ photodiodes ถล่มหรือการคูณอิเล็กตรอนทำให้นักวิจัยสามารถสังเกตพฤติกรรมของโมเลกุลแต่ละตัวเป็นเวลาไม่กี่วินาทีและในบางกรณีอาจถึงนาที

ความซับซ้อน

ปัญหาสำคัญคือการปราบปรามของเสียงจากพื้นหลังแสง เนื่องจากความจริงที่ว่าวัสดุหลายชนิดที่ใช้ในการออกแบบตัวกรองและเลนส์มีการหลั่งออกของแสงอัตโนมัติบางส่วนความพยายามของนักวิทยาศาสตร์ในขั้นเริ่มต้นจึงมุ่งเน้นการผลิตชิ้นส่วนที่มีการเรืองแสงต่ำ อย่างไรก็ตามการทดลองที่ตามมานำไปสู่ข้อสรุปใหม่ , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. โดยเฉพาะอย่างยิ่งพบว่า กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง อิงจากการสะท้อนภายในทั้งหมดทำให้พื้นผิวต่ำและมีฟลักซ์แสงที่น่าตื่นเต้นมาก

กลไก

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. หลักการของกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง ขึ้นอยู่กับการสะท้อนภายในทั้งหมดประกอบด้วยการใช้คลื่นที่สลายตัวหรือไม่แพร่กระจายอย่างรวดเร็ว มันเกิดขึ้นบนพรมแดนของสื่อที่มี ดัชนีการหักเหที่ แตกต่างกัน ในกรณีนี้แสงจะผ่านปริซึม มีดัชนีหักเหสูง

ปริซึมอยู่ติดกับสารละลายน้ำหรือแก้วที่มีพารามิเตอร์ต่ำ ถ้าลำแสงของแสงตรงไปที่มุมนั้นมากกว่ามุมที่สำคัญลำแสงจะสะท้อนออกมาจากอินเทอร์เฟซ ปรากฏการณ์นี้ทำให้เกิดคลื่นที่ไม่ใช่การแพร่กระจาย กล่าวคือสร้างสนามแม่เหล็กไฟฟ้าที่แทรกซึมเข้าไปในสื่อที่มีดัชนีหักเหน้อยกว่า 200 นาโนเมตร

ในคลื่นที่ไม่ใช่ พริกปรมาณูความเข้มของแสง จะเพียงพอที่จะกระตุ้น fluorophores อย่างไรก็ตามเนื่องจากความลึกไม่สำคัญมากปริมาณของมันจะมีขนาดเล็กมาก ดังนั้นพื้นหลังในระดับต่ำจะปรากฏขึ้น

การแก้ไข

กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงอิงกับการสะท้อนภายในทั้งหมดสามารถรับรู้ได้ด้วยความช่วยเหลือของ epi-illumination นี้ต้องใช้เลนส์ที่มีรูรับแสงที่เพิ่มขึ้น (อย่างน้อย 1.4 แต่เป็นที่น่าพอใจที่จะถึง 1.45-1.6) รวมทั้งบางส่วนที่สว่างไสวของอุปกรณ์ สามารถทำได้โดยใช้จุดที่มีขนาดเล็ก เพื่อให้มีความเหมือนกันมากขึ้นแหวนบาง ๆ ถูกนำมาใช้โดยผ่านส่วนของการไหลที่ถูกบล็อก เพื่อให้ได้มุมที่สำคัญหลังจากที่มีการสะท้อนที่สมบูรณ์เกิดขึ้นจะต้องมีการหักเหของสารสื่อความเข้มสูงในเลนส์และกระจกครอบของกล้องจุลทรรศน์ในระดับสูง